주요연구성과

View

핵산의 절단 및 중합 연쇄 반응 시스템 기반 등온 핵산 증폭 기술을 이용한 표적 RNA 검출 방법
작성일 21/01/18 (13:48)조회수 4172

핵산의 절단 및 중합 연쇄 반응 시스템 기반 등온 핵산 증폭 기술을 이용한 표적 RNA 검출 방법
박현규(한국과학기술원)

성과개요


연구기관/연구책임자	한국과학기술원 / 박현규
과제명	On-site 보급형 분자진단 플랫폼 개발
성과개요	Reverse transcription-PCR (RT-PCR)은 높은 정확도 및 민감도로 인해 표적 RNA 검출의 표준 기술로서 사용됨. 하지만, RT-PCR 기술을 구현하기 위해서는 핵산 증폭 반응을 위한 정교한 온도 조절이 요구되며, 이는 진단기기의 소형화를 방해하는 요인으로 작용함. 따라서, RT-PCR 기술은 진단 설비가 갖추어진 대형 병원 또는 전문 진단 센터 등의 시설에서만 제한적으로 사용될 수 있다는 단점이 있음.
	상기 단점을 해결 가능한 표적 RNA 검출 기술로서 nucleic acid sequence-based amplification (이하 NASBA) 기술이 개발됨. NASBA 기술은 등온 조건 (41 ℃)에서 표적 RNA의 증폭 반응이 구현되는 등온 핵산 증폭 기술임. 하지만, 본 기술의 경우, RNA 증폭 반응이 오직 T7 RNA 중합효소의 전사 반응에만 의존함. 따라서, 표적 RNA로부터 T7 프로모터를 포함하는 이중가닥 DNA가 생성되는 반응의 효율이 낮을 경우, RNA 증폭 반응 효율이 저하될 수 있으며, 이는 착오 신호 (false signal)를 발생시키는 요인으로 작용할 수 있음.
	본 연구에서는 기존 NASBA 기술의 단점을 해결하기 위해, 절단효소 및 DNA 중합효소의 연쇄 반응과 T7 RNA 중합효소 반응을 융합함으로써, 기존 NASBA 기술 대비 높은 증폭 효율을 가지는 신개념 등온 핵산 증폭 반응 (Nicking/Extension chain reaction System-Based isothermal nucleic acid Amplification (NESBA))을 구현하였음.
	본 연구에서는 최근 전 세계적으로 대유행하고 있는 코로나바이러스 감염증 (COVID-19)을 일으키는 병원체인 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)를 목표 병원체로 선정함. NESBA 기술을 통해 병원체를 빠르고 민감하게 검출하였으며, 뿐만 아니라 검체 검출을 바탕으로 임상 적용 가능성을 확보하였음.

▲ 그림1 Nicking/Extension chain reaction System-Based isothermal nucleic acid Amplification (NESBA)

▲ 그림2 NESBA 기반 SARS-CoV-2 검출 한계 실험

▲ 그림3 RT-PCR 및 NESBA 기반 SARS-CoV-2 임상 실험 결과 (Tt : threshold time)

성과내용

주요내용

- 본 NESBA 기술에서는 기존 NASBA 기술과 달리 절단효소 인식 염기서열이 수식된 프라이머가 반응에 참여함으로써, T7 프로모터 및 절단효소 인식 염기서열이 수식된 이중가닥 DNA가 생성됨. 절단효소 인식 염기서열이 존재할 경우, 절단효소에 의해 이중가닥 DNA의 단일가닥이 절단됨. 상기 절단 반응에 의해 생성된 짧은 DNA 가닥은 새로운 DNA 합성을 위한 프라이머로서 사용되어, DNA 중합효소에 의해 새로운 DNA 합성 반응이 진행됨. 본 반응에서 사용되는 DNA 중합효소는 DNA 합성 반응 중 주형과 결합된 DNA를 밀어내는 활성 (strand displacement activity)을 가지고 있음. 따라서, 상기 생성된 짧은 DNA 가닥을 프라이머로서 사용하여 새로운 DNA가 합성될 경우, 주형과 미리 결합되어있는 DNA가 떨어져 나오게 됨. 주형으로부터 떨어져 나온 DNA는 반응에 참여하지 않은 프라이머와 결합하여 새로운 이중가닥 DNA를 생성할 수 있음. 이와 같이, 절단효소 및 DNA 중합효소 활성을 기반으로 한 핵산의 절단 및 중합 연쇄 반응을 구현함으로써, T7 프로모터를 포함하는 이중가닥 DNA를 지수함수적으로 증폭시키고, 결과적으로, 기존 NASBA 반응 대비 향상된 증폭 효율을 보이는 신개념 등온 핵산 증폭 반응 (NESBA)을 개발하였음. (그림 1)

- 그림 2는 NESBA 기술의 SARS-CoV-2 검출 한계 실험 결과를 나타냄. SARS-CoV-2 gRNA의 농도를 107 copies부터 10 배씩 농도를 낮추며 10 copies까지 실험을 진행하였으며, 실험 결과 envelop (E) gene과 nucleocapsid (N) gene에서 각각 10, 100 copies의 검출 한계를 확보하였음.

- 또한, 그림 3은 NESBA 기술 기반 SARS-CoV-2 임상 실험 결과를 나타냄. Seegene allplexTM 2019-nCoV Assay kit를 사용한 RT-PCR 결과를 양/음성 판별 기준으로 NESBA 결과를 해석 하였음. 총 93 개의 임상 샘플을 이용한 실험 결과, E gene과 N gene 모두 100 %의 clinical sensitivity와 specificity를 확보하였음..

혁신성

기존 지식/기술 대비 성과의 차별성 :

- 본 연구에서 개발된 NESBA 기술은 기존 PCR 기술 대비 진단기기의 소형화 측면에서 유리할 뿐만 아니라, 종래의 등온 핵산 증폭 기술 (NASBA) 대비 높은 핵산 증폭 효율을 보임.

우수성

세계최고 수준의 성과와 비교 :

- 본 연구에서 개발된 NESBA 기술은 현재 글로벌 분자진단 시장에서 가장 우수한 검출 성능을 보이는 Abbott社의 ID-NOWTM 시스템에 적용된 등온 핵산 증폭 기술 (nicking enzyme amplification reaction (NEAR))과 필적할 만한 표적 RNA 검출 성능을 보임.

주요 기능/사양


주요기능/사양	내용
주요기능/사양	세계 최고 수준	현재 개발 수준
기술	NEAR	NESBA
보유 기관/국가	Alere/미국	H-GUARD/대한민국
표적 물질	Severe acute respiratory syndrome corona virus 2 (SARS-CoV-2)
검출 시간 (min)	15	60
민감도 (TCID50/mL)	20	5

기대효과 및 향후계획


학술적/기술적 기대효과	신개념 등온 핵산 증폭 원천 기술의 접목을 통해, 현장 적용이 가능한 소형 유전자 분석 기기 개발이 가능할 것으로 판단됨.
경제적 기대효과	본 신개념 등온 핵산 증폭 기술을 기반으로 한 현장응답형 유전자 분석 기기의 개발은 현재까지 글로벌 체외진단 시장에서도 성공 사례가 드문 연구 개발이며, 높은 제품 경쟁력을 확보할 수 있을 것으로 판단됨.
기타 기대효과	본 신개념 등온 핵산 증폭 기술의 활용을 통해, 다양한 병원체 유래 질병의 조기 진단을 위한 현장응답형 검출 기기의 개발이 가능할 것으로 판단됨.
향후 계획	본 연구 개발을 통해 샘플 투입 후 결과 분석까지의 과정이 통합된 sample-to-answer 시스템을 구현하고자하며, 최종적으로 디스크 기반 분자진단 플랫폼에 접목 및 성능을 확보할 예정임.

성과근거자료

주요연구실적

국내 특허 출원: 출원번호 10-2017-0183675
국내 특허 등록: 등록번호 10-2014470-0000
해외 특허 출원: 출원번호 PCT/KR2018/016946, 16/958683
기술이전
- 기술이전 방식: 통상실시권
- 실시기업: 바이오메디쿠스(주)
- 실시 기간: ~2023년 12월 31일
- 기술료: 50,000,000원
- 경상기술료: 총 매출액이 100,000,000원 이상 발생한 시점부터 총 매출액의 3%를 연구기관
(한국과학기술원 및 재)바이오나노헬스가드연구단)에 납부